玉米赤霉烯酮免疫親和柱

使用對(duì)象

玉米赤霉烯酮免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的玉米赤霉烯酮。玉米赤霉烯酮免疫親和柱廣泛地應(yīng)用于糧食、食品、飼料、堅(jiān)果、花生、醬油、醋、辣椒、胡椒、藥材和酒類等樣品的提取，該方法速度快、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高，對(duì)準(zhǔn)確靈敏的測(cè)定樣品中的玉米赤霉烯酮起到十分重要的作用。

玉米赤霉烯酮免疫親和柱適用于以下標(biāo)準(zhǔn)：

GB/T 23504-2009 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法

GB/T 5009.209-2008 谷物中玉米赤霉烯酮的測(cè)定

SN/T 1172-2006 進(jìn)出口糧谷中玉米赤霉烯酮的測(cè)定免疫親和柱-液相色譜法

SN/T 1175-2006 進(jìn)出口大豆油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的測(cè)定

GB/T 5009.209-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定

GB/T 28716-2012 飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

原理

 樣品經(jīng)提取液提取、過(guò)濾、稀釋，然后通過(guò)鍵合有玉米赤霉烯酮特殊抗體的免疫親和柱。此時(shí)，玉米赤霉烯酮被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將玉米赤霉烯酮從親和柱上洗脫下來(lái)。最后，用HPLC或熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。

 

儲(chǔ)存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對(duì)不能冷凍，保質(zhì)期為18個(gè)月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實(shí)驗(yàn)溶液制備

• 提取液，乙腈/水（8+2）：取80mL乙腈加20mL水，混合均勻。
• 提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均勻。
• HPLC流動(dòng)相，乙腈/水/甲醇（46+46+8）：取460mL乙腈和80mL甲醇于1L容量瓶中，用純水定容至1L，用0.22微米的尼龍篩過(guò)濾。
• 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，流動(dòng)相為稀釋液，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。例如：取100uL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液10ug/mL于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至10mL，那么，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100ng/mL          

注：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液有效期為7天。  。

• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。

液相色譜條件 

    色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動(dòng)相：乙腈/水/甲醇（46+46+8）

流速：0.8mL/min

檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)274nm,發(fā)射波長(zhǎng)440nm; 紫外檢測(cè)器：   265nm

進(jìn)樣體積：20~100uL

分析步驟

• 樣品提取及稀釋：

谷物、糧食、花生及其制品、大豆、植物油、調(diào)料等樣品： 稱取40g磨細(xì)的樣品，5g 氯化鈉；置于250mL具塞錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入100mL乙腈/水（9+1）溶液。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min，或搖床震蕩60min。取下蓋子，將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取10 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用40 mL純水稀釋，混勻。將上步稀釋液通過(guò)玻璃微纖維過(guò)濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

飼料樣品：

稱取40g磨細(xì)的樣品，5g 氯化鈉；置于250mL具塞錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入100mL乙腈/水（8+2）溶液。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min，或搖床震蕩60min。取下蓋子，將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取10 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用40 mL pH 7.0 PBS溶液稀釋，混勻。將上步稀釋液通過(guò)玻璃微纖維過(guò)濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

酒類：

稱取20g樣品（含二氧化碳類酒稱取前置于4℃冰箱冷藏30min，然后過(guò)濾或超聲制樣），置于50mL容量瓶中，加入乙腈定容至50mL，搖勻。移取10 mL上步的溶液，置于干凈的容器中。用40 mL純水稀釋，混勻。將上步稀釋液通過(guò)玻璃微纖維過(guò)濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

醬油，醋，醬及醬制品：

稱取25g樣品，置于100mL容量瓶中，加入乙腈定容至100mL，超聲提取2min。將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取10 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用40 mL純水稀釋，混勻。將上步稀釋液通過(guò)玻璃微纖維過(guò)濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

2） 樣品的凈化

將上步10 mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過(guò)玉米赤霉烯酮免疫親合柱，直至空氣進(jìn)入到親合柱中。用10 mL純水以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱2次。用1.5 mL HPLC級(jí)的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗親合柱，將所有樣品淋洗液（1.5 mL)收集于玻璃測(cè)試管中。將1.5mL淋洗液用1.5mL純水稀釋，混勻，注入HPLC檢測(cè)；或?qū)?.5mL淋洗液在50℃氮?dú)庀麓蹈?，?mL流動(dòng)相定容后，混勻，注入HPLC檢測(cè)。        

 

         高效液相色譜儀檢測(cè)玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

注意事項(xiàng)

• 樣品添加回收試驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中，靜置2小時(shí)后或過(guò)夜，再進(jìn)行樣品前處理，否則會(huì)出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
• 不要隨便更改操作說(shuō)明書(shū)中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認(rèn)更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過(guò)柱，淋洗，洗脫時(shí)，一定要控制好流速，不能太快，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。
• 如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過(guò)柱驗(yàn)證回收率時(shí)，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中乙腈濃度不要超過(guò)20%，否則會(huì)影響柱子的吸附能力。
• 試驗(yàn)中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過(guò)的儀器，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。
• 當(dāng)用氮?dú)鉂饪s洗脫液時(shí)，氮?dú)饬鞑灰螅駝t會(huì)損失部分玉米赤霉烯酮。

 

               需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑

物品

泵流操作架（配有1臺(tái)空氣泵，6個(gè)10mL針筒）

高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達(dá)18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測(cè)試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個(gè)/包)

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品

色譜純級(jí)的甲醇（4升/瓶）

色譜純級(jí)的乙腈（4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色譜柱4.6*250mm（5um）

玉米、飼料等基質(zhì)含有不同水平玉米赤霉烯酮的質(zhì)控樣品