黃曲霉毒素M1免疫親和柱

使用對象

免疫親和柱能夠特異性的純化牛奶及奶制品中黃曲霉毒素 M1。由于采用了先進的生物技術(shù)，該方法可以不使用有毒溶劑如氯仿和二氯甲烷檢測黃曲霉毒素M1的含量。Afla M1黃曲霉毒素免疫親和柱可以廣泛地應(yīng)用于牛奶加工廠質(zhì)量管理實驗室和政府檢測實驗室。此方法速度快、操作簡單、準(zhǔn)確性高，同時能做到提高奶質(zhì)，不產(chǎn)生污染。

黃曲霉毒素M1免疫親和柱適用于以下標(biāo)準(zhǔn)：

GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法

GB/T 5413.37-2010 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定

GB 5009.24-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測定

原理

樣品經(jīng)前處理后，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，黃曲霉毒素M1被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素M1從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進行定量檢測

儲存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質(zhì)期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

 

實驗溶液制備

• HPLC流動相，水-乙腈-甲醇（68+24+8，v/v）：取240mL乙腈和80mL水甲醇加680mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
• 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相稀釋到所需工作濃度。
•  注：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。

液相色譜條件

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動相：水-乙腈-甲醇（68+24+8，v/v）

流速：0.8mL/min

檢測器：熒光檢測器: 激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長440nm

  紫外檢測器：波長365nm（紫外檢測方法：建議標(biāo)準(zhǔn)曲線濃   度:5-50ng/ml）

進樣體積：20~100uL

 

分析步驟

1 新國標(biāo)GB 5009.24-2016方法：

1.1 樣品提取及稀釋：

  液態(tài)乳、酸奶：

稱取 4g 混合均勻的試樣(精確到 0.001g )于 50mL 離心管中, 加入 10mL 甲醇,渦旋 3min 。置于 4 ℃、6000r / min 離心10min 或經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾,將適量上清液或濾液轉(zhuǎn)移至燒杯中,加 40mL 水或 PBS 稀釋,備用。

乳粉、特殊膳食用食品：

稱取1g樣品(精確到0.001g)于50mL離心管中,加入4mL 50℃熱水,渦旋混勻。如果乳粉不能完全溶解,將離心管置于 50℃的水浴中,將乳粉完全溶解后取出。待樣液冷卻至20℃后,加入10mL甲醇,渦旋3min。置于 4℃、6000r/min下離心10min或經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾,將適量上清液或濾液轉(zhuǎn)移至燒杯中,加40mL 水或PBS稀釋,備用。

奶油：

稱取1g樣品(精確到0.001g)于50mL離心管中,加入8mL 石油醚,待奶油溶解,再加9mL 水和11mL 甲醇,振蕩30min,將全部液體移至分液漏斗中。加入0.3g氯化鈉充分搖動溶解,靜置分層后,將下層移到圓底 燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10mL以下,用PBS稀釋至30mL。

奶酪：

稱取1g已切細、過孔徑1mm~2mm 圓孔篩混勻樣品(精確到0.001g)于50mL離心管中,加入1mL水和18mL甲醇,振蕩30min,置于4℃、6000r/min下離心10min或經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾,將適量上清液或濾液轉(zhuǎn)移至圓 底燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2mL以下,用PBS稀釋至30mL。

1.2樣品的凈化

免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后,將上述樣液移至50mL注射器筒中,調(diào)節(jié)下滴流速為1mL/min~3mL/min。待樣液滴完后,往注射器筒內(nèi)加入10mL水,以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后,用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng),在親和柱下放置10mL刻度試管,取下50mL的注射器筒,加入 2×2mL乙腈(或甲醇)洗脫親和柱,控制1mL/min~3mL/min下滴速度,用真空泵抽干親和柱,收集 全部洗脫液至刻度試管中。在50℃下氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干,用初始流動相定容至1.0mL,渦 旋30s溶解殘留物,0.22μm 濾膜過濾,收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

2 老國標(biāo)方法：

2.1樣品提取及稀釋：

乳：

量取100mL混勻的試樣，置于兩個50 mL具塞離心管中，在水浴中加熱到35℃～37 ℃。在4000~6000 g下離心15 min。收集并混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。

發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)：

稱取100 g(精確至0.01 g)混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調(diào)pH至7.4，高速勻漿5 min。在4000~6000 g下離心15 min。收集并混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。

乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品：

稱取 10 g(精確至0.01 g)試樣，置于250 mL 燒杯中。將50 mL 已預(yù)熱到50 ℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒將其混合均勻。如果乳粉仍未完全溶解，將燒杯置于50℃的水浴中放置30 min。溶解后冷卻至20 ℃，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗滌燒杯，洗滌液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后分別移至兩個50 mL離心管中，在4000~6000 g離心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。

干酪：

稱取經(jīng)切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加20 mL水和30 mL甲醇，高速勻漿5 min，超聲提取30 min，在4000~6000 g下離心15 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚振搖2 min，待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。重復(fù)用石油醚提取2次。將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL，濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中，加水稀釋至約50 mL，在4000~6000 g下離心 5 min，上清液供凈化處理。

奶油：

稱取5g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL燒杯中，用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中，待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供凈化處理。

2.2樣品的凈化

 將以上試液提取液移至50 mL 注射器筒中，調(diào)節(jié)固相萃取裝置的真空系統(tǒng),控制試樣以1~2滴/秒穩(wěn)定的流速過柱。取下50 mL 的注射器筒，裝上10 mL 注射器筒。注射器筒內(nèi)加入水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后，抽干親和柱。脫開真空系統(tǒng)，在親和柱下部放入10 mL 刻度試管，上部裝上另一個10 mL 注射器筒，加入4 mL 乙腈,洗脫黃曲霉毒素M1，洗脫液收集在刻度試管中，洗脫時間不少于60 秒。然后用氮氣緩緩地在30 ℃下將洗脫液蒸發(fā)至近干 (如果蒸發(fā)至干，會損失黃曲霉毒素M1 )，用流動相稀釋至1 mL。

注意事項

• 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中甲醇濃度不要超過20%，否則會影響柱子的吸附能力。
• 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 當(dāng)用氮氣濃縮洗脫液時，氮氣流不要太大，否則會損失部分黃曲霉毒素M1

 

   需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑

物品

泵流操作架

高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個/包)

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品

色譜純級的甲醇和乙腈（4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

奶粉等基質(zhì)含有不同水平黃曲霉毒素的質(zhì)控樣品