T-2毒素免疫親和柱

使用對(duì)象

T-2毒素免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的T-2毒素。T-2毒素免疫親和柱廣泛地應(yīng)用于糧食、食品、飼料、等樣品的提取，該方法速度快、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高，對(duì)準(zhǔn)確靈敏的測(cè)定樣品中的T-2毒素起到十分重要的作用。

T-2毒素免疫親和柱適用于以下標(biāo)準(zhǔn)：

GB/T 5009.118-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中T-2毒素的測(cè)定

GB/T 23501-2009 食品中T-2毒素的測(cè)定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法

GB/T 28718-2012 飼料中T-2毒素的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

原理

 樣品經(jīng)提取液提取、過(guò)濾、稀釋，然后通過(guò)鍵合有T-2毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時(shí)，T-2毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將T-2毒素從親和柱上洗脫下來(lái)。然后，用HPLC或熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。

儲(chǔ)存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對(duì)不能冷凍，保質(zhì)期為18個(gè)月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實(shí)驗(yàn)溶液制備

• 提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均勻。
• 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，流動(dòng)相為稀釋液，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。例如：取100uL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液100ug/mL于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至10mL，那么，T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0ug/mL
• 注：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液冷藏保存有效期為7天。
• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，之后用純水稀釋至1000mL。
• 4-二甲基氨基吡啶溶液: 準(zhǔn)確稱取0.0325g4-二甲基氨基吡啶于100mL容量瓶中,用甲苯定容 至刻度。
• 1-蒽腈溶液: 準(zhǔn)確稱取0.030g1-蒽腈于100mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度

液相色譜條件

熒光法

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動(dòng)相：乙腈/水（75+25）

檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)381nm,發(fā)射波長(zhǎng)470nm;

進(jìn)樣體積：20uL

紫外法（無(wú)需衍生）

色譜柱：Agilent C18 4.6*150mm（5um）

流動(dòng)相：甲醇/水（55+45）

檢測(cè)器：波長(zhǎng)208nm,

進(jìn)樣體積：50-100uL

分析步驟

• 樣品提取及稀釋：

糧食及糧食制品:

將樣品研磨,硬質(zhì)的糧食等用高速粉碎機(jī)磨細(xì)并通過(guò)試驗(yàn)篩。稱取25.0g(精確到0.1g)過(guò)篩樣品于均質(zhì)杯中,加入提取液100mL,以均質(zhì)器高速攪拌提取2min,定量濾紙過(guò)濾。 移取10.0mL濾液加入40mL水稀釋混勻,經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清,濾液備用。

醬油、醋、醬及醬制品：

稱取25.0g(精確到0.1g)混勻的試樣,用甲醇定容至50.0mL,超聲提取10min,定量濾紙過(guò)濾。 移取10.0mL濾液加入40mL水稀釋混勻,經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清,濾液備用。

酒類：

取脫氣酒類試樣(含二氧化碳的酒類使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,過(guò)濾或超聲脫氣)或其他不含二氧化碳的酒類試樣20.0g(精確到0.1g)于50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,定量濾紙 過(guò)濾。移取10.0mL濾液加入40mL水稀釋,經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清,濾液備用。

 2） 樣品的凈化

將免疫親和柱連接于玻璃注射器下,準(zhǔn)確移取10.0mL上述提取濾液,注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調(diào)節(jié)壓力使溶液以約1滴/s的流速緩慢通過(guò)免疫親和柱,直至空氣進(jìn)入親和柱中。用10mL水淋洗親和柱,流速為1滴/s~2滴/s,直至空氣進(jìn)入親和柱中,棄去全部流出 液,抽干小柱。準(zhǔn)確加入1.0mL甲醇洗脫,流速約為1滴/s,收集洗脫液。

衍生：標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品洗脫液各1mL,在50℃ 下用氮?dú)獯蹈?加入50μL4-二 甲基氨基吡啶溶液和50μL1-蒽腈溶液,在渦旋混合器上混勻1min,50℃反應(yīng)15min,在冰水中冷卻10min后取出,50℃下氮?dú)獯蹈?用1.0mL流動(dòng)相溶解,待 HPLC測(cè)定。

注意事項(xiàng)

• 樣品添加回收試驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中，靜置2小時(shí)后或過(guò)夜，再進(jìn)行樣品前處理，否則會(huì)出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
• 不要隨便更改操作說(shuō)明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認(rèn)更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過(guò)柱，淋洗，洗脫時(shí)，一定要控制好流速，不能太快，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。
• 如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過(guò)柱驗(yàn)證回收率時(shí)，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中甲醇濃度不要超過(guò)25%，否則會(huì)影響柱子的吸附能力。
• 試驗(yàn)中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過(guò)的儀器，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。
• 當(dāng)用氮?dú)鉂饪s洗脫液時(shí)，氮?dú)饬鞑灰螅駝t會(huì)損失部分T-2毒素。
• 衍生實(shí)驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品建議一起衍生，這樣避免不同批次衍生之間的差異

 需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑

物品

4-二甲基氨基吡啶

1-蒽腈

泵流操作架（配有1臺(tái)空氣泵，6個(gè)10mL針筒）

高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達(dá)18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測(cè)試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個(gè)/包)

T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品

色譜純級(jí)的甲醇（4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色譜柱4.6*250mm（5um）

玉米、飼料等基質(zhì)含有不同水平T-2毒素的質(zhì)控樣品