雜色曲霉毒素免疫親和柱

使用對象

雜色曲霉毒素免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的雜色曲霉毒素。雜色曲霉毒素免疫親和柱廣泛地應(yīng)用于糧食、食品、飼料、堅果、花生、醬油、醋、辣椒、胡椒、藥材和酒類等樣品的提取，該方法速度快、操作簡單、準(zhǔn)確性高，對準(zhǔn)確靈敏的測定樣品中的雜色曲霉毒素起到十分重要的作用。

原理

樣品經(jīng)提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有雜色曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，雜色曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將雜色曲霉毒素從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進(jìn)行定量檢測。

儲存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質(zhì)期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實(shí)驗(yàn)溶液制備

• HPLC流動相，甲醇/水（75+25）：取750mL甲醇加250mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。

液相色譜條件

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動相：甲醇-水（75+25，v/v）

流速：0.8mL/min

檢測器：紫外檢測器，波長325 nm

進(jìn)樣體積：20~100uL

 

分析步驟

方法1：樣品提取及稀釋：

準(zhǔn)確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉，準(zhǔn)確加入100.0mL,80%甲醇水，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取5mL濾液，然后用pH 7.0 PBS溶液定容至50mL，用玻璃纖維濾紙過濾，取濾液10 mL，備用。

 方法2：樣品提取及稀釋：

準(zhǔn)確稱取試樣40.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入100.0mL乙腈，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取20.0mL濾液，50℃氮?dú)獯蹈蓛x下氮吹，吹干后，加入1mL甲醇溶解沉淀物，然后用pH 7.0 PBS溶液定容至20mL，用玻璃纖維濾紙過濾，取濾液10 mL，備用。

 

樣品的凈化   

   將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

注意事項(xiàng)

• 樣品添加回收試驗(yàn)時，標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進(jìn)行樣品前處理，否則會出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
• 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認(rèn)更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過柱驗(yàn)證回收率時，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中甲醇濃度不要超過15%，否則會影響柱子的吸附能力。
• 試驗(yàn)中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結(jié)果偏低。

  需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑

物品

泵流操作架（配有1臺空氣泵，6個10mL針筒）

高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達(dá)18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個/包)

雜色曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品

色譜純級的甲醇（4升/瓶）

色譜純級的乙腈4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）