赭曲霉毒素A免疫親和柱

使用對象

赭曲霉毒素A免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的赭曲霉毒素A。赭曲霉毒素A免疫親和柱廣泛地應(yīng)用于糧食、飼料、大豆、油菜籽、植物油、醬油、醋、醬及醬制品和酒類等樣品的提取，該方法速度快、操作簡單、準(zhǔn)確性高，對準(zhǔn)確靈敏的測定樣品中的赭曲霉毒素A起到十分重要的作用。

赭曲霉毒素A免疫親和柱適用于以下標(biāo)準(zhǔn)：

GB/T 23502-2009 食品中玉赭曲霉毒素A的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法

SN/T 1746-2006 進(jìn)出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的檢測方法

GB/T 5009.96-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中赭曲霉毒素A的測定

GB/T 30957-2014 飼料中赭曲霉毒素A的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

原理

樣品經(jīng)提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有赭曲霉毒素A特殊抗體的免疫親和柱。此時，赭曲霉毒素A被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將赭曲霉毒素A從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進(jìn)行定量檢測。

儲存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質(zhì)期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實(shí)驗溶液制備

• 提取液1，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均勻。
• 提取液2，稱取150g氯化鈉，20g碳酸氫鈉溶于900mL水中，用水定容至1L
• HPLC流動相，乙腈/水/乙酸（99+99+2）：取495mL乙腈和10mL乙酸于1L容量瓶中，用純水定容至1L，用0.22微米的尼龍篩過濾
• 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液，流動相為稀釋液，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。例如：取100uL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液10ug/mL于10mL容量瓶中，用流動相定容至10mL，那么，赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100ng/mL              

  注：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液有效期為7天

• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
• 沖洗液：稱取25g氯化鈉，5g碳酸氫鈉溶于900mL水中，用水定容至1L
• 真菌毒素清洗緩沖液：稱取25g氯化鈉，5g碳酸氫鈉溶于900mL水中，加入0.1mL吐溫-20，用水定容至1L

 

液相色譜條件

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動相：乙腈/水/乙酸（99+99+2）

流速：0.8mL/min

檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長333nm,發(fā)射波長477nm

進(jìn)樣體積：20~100uL

 

分析步驟

• 樣品提取及稀釋：

谷物、糧食、大豆、油菜籽、植物油等樣品：

稱取20g磨細(xì)的樣品，5g 氯化鈉；置于250mL具塞錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入100mL甲醇/水（8+2）溶液。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min。取下蓋子，將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取10 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用40 mL純水稀釋，混勻。將上步稀釋液通過玻璃微纖維過濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

飼料,辣椒樣品：

稱取25g磨細(xì)的樣品，5g 氯化鈉；置于250mL具塞錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入100mL甲醇/水（8+2）溶液。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min。取下蓋子，將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取5 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用45 mL pH 7.0 PBS溶液稀釋，混勻。將上步稀釋液通過玻璃微纖維過濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

酒類：

稱取20g樣品（含二氧化碳類酒稱取前置于4℃冰箱冷藏30min，然后過濾或超聲制樣），置于25mL容量瓶中，加入提取液2定容至25mL，搖勻。移取10 mL上步的溶液，置于干凈的容器中。用40 mL純水稀釋，混勻。將上步稀釋液通過玻璃微纖維過濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化。

醬油，醋，醬及醬制品：

稱取25g樣品，置于50mL容量瓶中，加入甲醇/水（8+2）定容至50mL，超聲提取2min。將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。移取10 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。用40 mL純水稀釋，混勻。將上步稀釋液通過玻璃微纖維過濾器，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL準(zhǔn)備上柱凈化.

 

• 樣品的凈化

谷物、糧食、大豆、油菜籽、植物油、飼料、辣椒、醬油，醋，醬及醬制品等樣品：

將上步10 mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過赭曲霉毒素A免疫親合柱，直至空氣進(jìn)入到親合柱中。用10 mL真菌毒素清洗液以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱；再用10mL純水以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱，直至空氣進(jìn)入到親合柱中。用1.5 mL HPLC級的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗親合柱，將所有樣品淋洗液（1.5 mL)收集于玻璃測試管中。將1.5mL淋洗液用1.5mL純水稀釋，混勻，注入HPLC檢測；或?qū)?.5mL淋洗液在50℃氮?dú)庀麓蹈?，?mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

酒類：

將上步10 mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過赭曲霉毒素A免疫親合柱，直至空氣進(jìn)入到親合柱中。用10 mL沖洗液以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱；再用10mL純水以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱，直至空氣進(jìn)入到親合柱中。用1.5 mL HPLC級的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗親合柱，將所有樣品淋洗液（1.5 mL)收集于玻璃測試管中。將1.5mL淋洗液用1.5mL純水稀釋，混勻，注入HPLC檢測；或?qū)?.5mL淋洗液在50℃氮?dú)庀麓蹈?，?mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

注意事項

• 親和柱凈化后的洗脫液不能用尼龍膜或有機(jī)系膜過濾，負(fù)責(zé)會損失部分赭曲霉毒素。
• 樣品添加回收試驗時，標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進(jìn)行樣品前處理，否則會出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
• 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認(rèn)更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中甲醇濃度不要超過25%，否則會影響柱子的吸附能力。
• 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 當(dāng)用氮?dú)鉂饪s洗脫液時，氮?dú)饬鞑灰?，否則會損失部分赭曲霉毒素。
• 需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑

物品

泵流操作架（配有1臺空氣泵，6個10mL針筒）

高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達(dá)18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個/包)

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品

色譜純級的乙腈（4升/瓶）

色譜純級的甲醇（4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色譜柱4.6*250mm（5um）

玉米、飼料等基質(zhì)含有不同水平赭曲霉毒素的質(zhì)控樣品