嘔吐毒素免疫親和柱

使用對象

嘔吐毒素免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的嘔吐毒素。嘔吐毒素免疫親和柱廣泛地應(yīng)用于糧食、食品、飼料、酒類、醬油、醋、醬及醬制品等樣品的提取，該方法速度快、操作簡單、準確性高，對準確靈敏的測定樣品中的嘔吐毒素起到十分重要的作用。

嘔吐毒素免疫親和柱適用于以下標準：

GB/T 23503-2009 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法

SN/T 1571-2005 進出口糧谷中嘔吐毒素檢測方法-液相色譜法

GB/T 30956-2014 飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定 免疫親和柱凈化高效液相色譜法

GB/T 5009.111-2016 食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定

原理

    樣品經(jīng)提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有嘔吐毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，嘔吐毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將嘔吐毒素從親和柱上洗脫下來。之后，用HPLC或熒光計進行定量檢測。

儲存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質(zhì)期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實驗溶液制備

• HPLC流動相，乙腈/水（1+9）：取100mL乙腈于1L容量瓶中，用純水定容至1L，用0.22微米的尼龍篩過濾。
• HPLC流動相，甲醇/水（2+8）：取200mL甲醇于1L容量瓶中，用純水定容至1L，用0.22微米的尼龍篩過濾。
• 標準溶液的配制：取嘔吐毒素標準儲備液，流動相為稀釋液，配制標準品溶液。例如：取100uL標準品儲備液100ug/mL于10mL容量瓶中，用流動相定容至10mL，那么，嘔吐毒素標準品濃度為1.0ug/mL

    注：配制好的標準品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。

• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，之后用純水稀釋至1000mL。

液相色譜條件

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動相：乙腈/水（1+9）或 甲醇/水（2+8）

流速：0.8mL/min

檢測器：紫外檢測器波長218nm

進樣體積：20~100uL

 

分析步驟

• 樣品提取及稀釋：
• 糧食、糧食制品、飼料樣品：

 稱取25g磨細的樣品，5g 聚乙二醇；置于250mL具塞錐形瓶中，或勻質(zhì)杯中。加入100mL純水。以均質(zhì)器高速勻質(zhì)提取2min。取下蓋子，將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。將上步提取液通過玻璃微纖維過濾器，收集濾液準備上柱凈化。

酒類：

稱取20g樣品（含二氧化碳類酒稱取前置于4℃冰箱冷藏30min，然后過濾或超聲制樣），置于25mL容量瓶中，加入1g聚乙二醇，用水定容至25mL，搖勻。用玻璃微纖維過濾器，收集濾液準備上柱凈化。

醬油，醋，醬及醬制品：

稱取25g樣品，置于100mL容量瓶中，加入水定容至100mL，超聲提取2min。將提取物到入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中。將上步提取液通過玻璃微纖維過濾器，收集濾液準備上柱凈化。

樣品的凈化

糧食、糧食制品、酒類、醬油，醋，醬及醬制品：

將上步2mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過嘔吐毒素免疫親合柱，直至空氣進入到親合柱中。用5 mL pH 7.0 PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱，再用5 mL純水以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱，直至空氣進入到親合柱中。用1.0 mL HPLC級的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗親合柱，將1.0mL淋洗液在50℃氮氣下吹干，用0.5mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

飼料：

將上步1mL濾液，以1滴/秒的流速全部通過嘔吐毒素免疫親合柱，直至空氣進入到親合柱中。用5 mL pH 7.0 PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱，再用5 mL純水以1-2滴/秒的流速淋洗親合柱，直至空氣進入到親合柱中。用1.0 mL HPLC級的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗親合柱，將1.0mL淋洗液在50℃氮氣下吹干，用0.5mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

注意事項

• 樣品添加回收試驗時，標準品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進行樣品前處理，否則會出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
• 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 如果將標準品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標準上柱液中甲醇濃度不要超過5%，否則會影響柱子的吸附能力。
• 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結(jié)果偏低。
• 當用氮氣濃縮洗脫液時，氮氣流不要太大，否則會損失部分嘔吐毒素。

 

                  需要準備的設(shè)備及試劑

物品

聚乙二醇PEG 8000

嘔吐毒素標準品

泵流操作架（配有1臺空氣泵，6個10mL針筒）

高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個/包)

色譜純級的乙腈（4升/瓶）

色譜純級的甲醇（4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）

C18 反相色譜柱4.6*250mm（5um）

玉米、飼料等基質(zhì)含有不同水平嘔吐毒素的質(zhì)控樣品